Kromatografi Kolom dan Permasalahnnya

Kromatografi Kolom

Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan kromatografi konvnsional yang bersejarah karena dari sinilah bermula metode kromatografi. Gambar disamping memperlihatkan diagram pemisahan kromatografi kolom. Kolom gelas dengan kran pada slah satu ujungnya didisi oleh fasa diam berupa silica atau alumina. Ukuran diameter partikl fasa diam berkisar 100 µm. Campuran yang akan dipisahkan dituangkan pada bagian atas kolomyang berisi fasa diam. Begitu pula fasa gerak berupa pelarut organik seperti heksan atau eter dialirkan dari bagian atas kolom. Komponen-komponen yang telah terpisah dari campurannyabergerak terbawa fasa gerak ke bawah kolom. Jumlah komponen penyusun campurandapat terlihat sebagai cincin-cincin berwarna sepanjang kolom gelas. Akhirnya, komponen-komponen campuran dari meninggalkan kolom gelas satu persatudan dapat ditampung pada tempat yang berbeda.

Metode pemisahan kromatografi kolom ini memerlukan bahan kimia yang cukup banyak sebagai fasa diam dan fasa gerak, bergantung pada ukuran kolom gelas. Untuk melakukan pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom diperlukan waktu yang relatif lama, bisa berjam-jam hanya untuk memisahkan satu campuran. Selain itu, hasil pemisahan kurang jelas artinya kadang-kadang sukar mendapatkan pemisahan secara sempurna karena pita komponen yang satu bertumpang tindih dengan komponen lainnya. Masalah waktu yang lama disebabkan laju alir fasa gerak hanya dipengaruhi oleh gaya gravitasi bumi. Ukuran diameter partikel yang cukup besar membuat luas pemukaan fasa diam relatif keci sehingga tempat untuk brinteraksi antara komponen-komponen dengan fasa diam menjadi terbatas. Apabila ukuran diameter partikel diperkecil supaya luas permukaan fasa diam bertambah maka menyebabkan semakin lambatnya aliran fasa gerak atau fasa gerak tidak mengalir sama sekali. Selain itu fasa diam yang sudah terpakai tidak dapat digunakan lagi untuk pemisahan campuran yang lain karena sukar meregenerasi fasa diam.

artikel ini diambil dari buku sumar hendayana, Ph.D.

Elektroforesis dan Permasalahannya

Elektroforesis

Berbeda dengan metode kromatografi, metode pemisahan elektroforesis memanfaatkan karaktristik medan listrik. Sumber arus searah bertegangan bsar merupakan salah satu komponen utama dalam metode elektroforesis. Larutan buffer diperlukan sebagai larutan elektrolit untuk menghantarkan arus listrik. Larutan buffer juga berperan menjaga pH karena muatan partikel komponen bergantung pada pH. Kertas saring atau gel bertindak sebagai media dalam percobaan elektroforesis. Gambar disamping memperlihatkan pemisahan dengan metode elektroforesis.

Campuran asam amino atau protein dapat dipisahkan dengan metode elektroforesis. Asam amino bisa bermuatan positif, negatif atau netral brgantung pada kondisi pH larutan. Ketiga jenis muatan asam amino bisa berada bersama-sama bila larutan asam amino dikondisikan pada harga pH tertentu dan kita bisa mengontrolnya melalui pengetahuan harag titik isoelektrik suatu asam amino. Sebagai contoh, glisin mempunyai harga titik isoelektrik 5,97 yang berarti pada pH 5,97glisin bersifat netral. Glisin bermuatan positif pada pH larutan dibawah 5,97, sebaliknya glisin bermuatan negatif pada pH diatas 5,97.

Biasanya analisis klinis elektroforesis serum dilakukan pada media krtas selulosa asetat dengan pH buffer 8,6. Pada pH ini semua protein  serum normal bermuatan negatif dan dalam sel elektroforesis semua protein bergerak ke anoda.

Pemisahan melalui metode elektroforesis memerlukan waktu yang relatif lama dalam kisaran jam. Kecepatan pemisahan dapat ditingkatkan melalui penambahan tegangan listrik searah yang digunakan. Akan tetapi, peningkatan tegangan listrik searah dapat menyebabkan noda hasil pemisahan menjadi tidak jelas akibat kerusakan noda oleh panas yang dihasilkan tegangan listrik searah yang tinggi. Noda-noda hasil pemisahan elektroforesis tidak terlalu jelas memisah.

artikel ini dikutip dari buku karangan sumar handayana, Ph.D.